常用蛋白浓度测定方法的比较

常用蛋白浓度测定方法的比较
蛋白浓度测定方法有很多种，各种蛋白质含量测定的研究也屡见报道。每种方法都有其优点和局限性，在蛋白质样品中往往会含有一些化学试剂，有些化学试剂会干扰蛋白浓度测定。因此，寻找合适的实验方法以避免干扰对蛋白浓度测定的准确性至关重要。基于Lowry法在测定PEG_IL_6样品时出现大量黄绿色沉淀，尿素对BCA法测定蛋白浓度测定有严重干扰，影响结果准确性，我们试验了另外两种方法，并进一步对方法进行了比较分析。
1 材料
Folin酚试剂、考马斯亮蓝G_250及4，4-二羧酸-2，2-二喹啉(BCA)均为Sigma公司产品；总蛋白(BSA)标准购自上海生物制品研究所；变性液为大肠杆菌破碎后加入β一巯基乙醇处理的样品；其它试剂均为国产分析纯。
2 方 法
Lowry法操作参考文献[4]。磺基水杨酸沉淀法操作参考文献[5]。Bradford法操作参考文献[6]，为方便试验稍作改变，即取0～500 gg／mL的样品100 L加Bradford试剂2 mL，室温放置5 min在595 nm波长处测定吸光度。
3 结 果
3．1 测定原理比较
Lowry法的测定原理为蛋白质与碱性硫酸铜作用形成铜-肽键络合物，后者与色氨酸和酪氨酸共同作用使酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸还原生成蓝色化合物；BCA法的测定原理为蛋白质价铜离子还原成亚铜离子，后者在碱性溶液中与BCA结合生成紫红色络合物。Lowry法与BCA法同属于化学法。磺基水杨酸沉淀法属于物理法，Bradford法属于染料结合法，即考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中呈红棕色，与蛋白质结合后转变为蓝色，颜色深浅与蛋白浓度呈正比关系。
3．3 BCA法测定PEG-IL-6蛋白浓度及Bradford法测定变性液中蛋白浓度的结果分析
对Lowry法测得的IL-6样品浓度为250 μg／mL，加入PEG修饰后再用BCA法测得的该样品的浓度为246 μg／mL，说明PEG对BCA法没有影响。对BCA法测定的包涵体变性液中蛋白浓度为25 mg／mL的样品用Bradford法测得只有1．59 mg／mL，对照试验显示包涵体变性液中的β一巯基乙醇严重干扰BCA法，而对Bradford法无影响。由此可见，Bradford法适于检测包涵体变性液。表2是连续10次对同一PEG-IL-6样品用BCA法测定和同一包涵体变性液样品用Bradford法测定的结果。
表2 BCA法测定PEG-IL-6和Bradford法测定包涵体变性液中蛋白浓度的重复性结果
4．1 蛋白浓度的测定范围
按照文献[4-7]所述方法操作，各种方法测定蛋白浓度的范围如下：Lowry法标准蛋白浓度设置范围为10～100 g／mL；BCA法标准蛋白浓度设置在20～ 1 000 g／mL时r值仍大于0．998；磺基水杨酸沉淀法标准蛋白浓度设置在50～500 g／mL时，r值才大于0．99，过高则产生的沉淀不易悬浮；Bradford法为31．25～2 000 g／mL。蛋白浓度测定方法的线性范围取决于所加样品中的蛋白质的摩尔数与所加试剂中有效化学成分的摩尔数之比，而非体积之比，因此，可以通过减少样品体积来提高检测范围的上限。
4．2 影响因素
影响Lowry法测定蛋白的主要因素有某些氨基酸、NH 、兼性离子缓冲液、非离子表面活性剂、蔗糖、含硫化合物；影响BCA法测蛋白的主要因素有蔗糖、NH4+、尿素、EDTA_7 J，磺基水杨酸沉淀法虽然克服了以上各种因素，但是不同的蛋白所形成的沉淀性质差别很大。如本试验所显示，用牛血清白蛋白作标准测定破伤风类毒素和IL-6蛋白含量误差可超过100％ ，且蛋白浓度越小误差越大，因此用此法测定蛋白含量时应选相同的或性质相近的蛋白做标准。影响Bradford法的主要因素有甘油、乙酸、去污剂和一些碱性缓冲系统。由于用Lowry法测定PEG-IL-6时会产生黄色沉淀，并且迅速沉淀到管底，无法用分光光度计测得均匀的吸光度。所以，测定PEG-IL-6等PEG化的蛋白浓度时不能采用Lowry法，但可以采用BCA法。包涵体的变性液和复性液中经常会含有尿素和β．巯基乙醇，这些物质会干扰BCA法的测定，所以BCA法不适于含有尿素和β．巯基乙醇的变性液中蛋白含量的测定。根据表1可知，磺基水杨酸沉淀法对每种样品检测偏差都较大，因此，沉淀法必须用与样品同质的已知蛋白含量的对照品测定，也不适于检测PEG-IL-6和变性液蛋白测定。通过表2的结果显示，BCA法检测PEG-IL-6的干扰少重现性高(RSD<5％)，而Bradford法可以不受变性液中的还原性物质干扰，对包涵体变性液中的蛋白浓度的检测比较准确，且重现性好(RSD<5％)。因此，对于PEG-IL-6等PEG修饰后的蛋白浓度测定*好采用BCA法，而对于包涵体变性液这种含有还原性物质的样品，其蛋白浓度测定*好采用Bradford法。